Ambiente Biotecnologia

Desenvolvimento e Aplicação de Marcadores Microssatélites em Maçaranduba (Manilkara huberi).

A Floresta Amazônica abriga uma enorme riqueza de essências florestais, além de suas propriedades madeireiras. Manilkara huberi (Ducke) Stand. (Sapotaceae), popularmente conhecida como maçaranduba é uma espécie amazônica madeireira intensamente explorada, cujas árvores podem atingir até 50m de altura

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A Floresta Amazônica abriga uma enorme riqueza de essências florestais, além de suas propriedades madeireiras. Manilkara huberi (Ducke) Stand. (Sapotaceae), popularmente conhecida como maçaranduba é uma espécie amazônica madeireira intensamente explorada, cujas árvores podem atingir até 50m de altura. Ocorre na Amazônia Brasileira, do Pará ao Amazonas, nas matas de terra firme e de várzeas pouco inundáveis; é a maior, mais procurada e de mais ampla dispersão das maçarandubas amazônicas, fornecendo quase a totalidade da madeira exportada por Belém. Devido a essa exploração, estudos de análise genômica têm sido realizados, gerando informações sobre a diversidade genética existente, sendo de fundamental importância na definição de estratégias adequadas para o manejo e a conservação de espécies nativas como a maçaranduba.

Para análises nesse nível os marcadores microssatélites, também denominados SSR ("Simple Sequence Repeats"), são uma ferramenta importante. Esses marcadores são formados por seqüências de uma a seis bases de comprimento repetidas em "tandem" (Jacob et al., 1991), têm herança codominante, são multialélicos, são encontrados em alta freqüência e com ampla distribuição nos genomas de eucariotos (Tóth et al., 2000), apresentando o maior conteúdo informativo por loco gênico entre todas as classes de marcadores moleculares (Goldstein, 2001).

Uma bateria de marcadores microssatélites para Manilkara huberi foi desenvolvida para o estudo da diversidade genética, do fluxo gênico e do sistema de cruzamento, de uma população mantida em um programa de manejo de corte florestal seletivo como parte do Projeto Dendrogene. O DNA total foi extraído segundo o protocolo de CTAB 2% (Ferreira & Grattapaglia, 1995) a partir de material caulinar coletado em Santarém – Amazônia Brasileira do Pará. A Enzima TSP 509 I foi a que gerou o perfil mais adequado de fragmentos para a construção da biblioteca enriquecida.

O processo de enriquecimento da biblioteca para elementos AG/TC foi verificada com alta eficiência na presença de um número alto de clones positivos com as seqüências com dinucleotídeos repetidos nos fragmentos. Foram obtidos 271 clones positivos no processo de hibridização dos quais 251 foram sequenciados. Foram obtidos microssatélites e seqüências flanqueadoras apropriados para o desenho de “primers” em 29 clones. Desses, sete não amplificaram e 22 amplificaram em temperaturas que variaram desde 52oC a 62oC. Verificou-se polimorfismo satisfatório em 14 “primers”, cinco apresentaram monomorfismo, e três não amplificaram fragmentos nítidos. Os 12 locos mais polimórficos (Tabela 1) foram selecionados para os estudos populacionais.

Os marcadores desenvolvidos neste trabalho abrem nova perspectiva para o aprofundamento de estudos genéticos na espécie M. huberi e representam uma ferramenta poderosa para a geração de dados genéticos populacionais fundamentais e indispensáveis às atividades de coleta, conservação in situ e ex situ.

Entre os 12 locos selecionados, nove apresentaram heterozigosidade esperada maior que 80%. Esses resultados mostram que esses locos são ideais para estudos de diversidade genética, fluxo gênico, sistemas de cruzamento e testes de paternidade. Por isso, esses locos SSRs, estão sendo utilizados nos estudos genéticos de uma população de Manilkara huberi, para avaliar os impactos da exploração madeireira, em 500 hectares sob monitoramento em Santarém-PA, como também para propor estratégias adequadas para o manejo desta espécie.

 

Locos N° de Repetições Fragmento pb Verificado T(°C) N A He Ho
Mh 03 (CT)17 176-204 56 12  7 0,859 1,000
Mh 04 (CT)12 189-209 52 12  5 0,768 0,583
Mh 06 (GA)14 162-188 56 12  7 0,754 0,417
Mh 07 (CT)23 153-187 56 12  4 0,746 0,750
Mh 08 (CT)11 172-202 56 12  7 0,862 0,917
Mh 12 (CT)9 (AC)6 187-211 56 12  7 0,859 0,667
Mh 17 (CT)13 240-274 56 12  6 0,721 0,750
Mh 19 (CT)21 146-164 56 12 7 0,862 0,750
Mh 20 (GA)13 134-166 56 12 8 0,848 0,833
Mh 22
(CT)15 180-206 56 12 7 0,841 0,833
Mh 24 (CT)17 181-209 60 12 7 0,815 0,167
Mh 26 (CT)14 224-250 58 12 6 0,819 0,583
média         6,43 0,813 0,688

 

Referências bibliográficas

FERREIRA, M.E. & GRATTAPAGLIA, D. Introdução ao uso de marcadores moleculares em análise genética.1995 2 ed. Brasília, DF: EMBRAPA-CENARGEN. 220pp.

GOLDSTEIN, B.D. & SCHLOTTERER, C. Microsatellites : Evolution and Applications. Oxford University Press, pp 352. 2001.

JACOB, H.J., Lindpaintner, K., Lincoln, S.E., Kusumi, K., Bunker, R.K., Mao, Y.P., Ganten, D., Dzau, V.J., Lander, E.S. (1991). Genetic mapping of a gene causing hypertension in the stroke-prone spontaneously hypertensive rat. Cell 67: 213-24

TÓTH,G., Gáspari, Z., Jurka, J (2000). Microssatelites in different eukaryotic genomes: survey and analysis. Genome Res. 10: 967-81.

Tabela 1. Dados sobre os 12 locos microssatélites (SSR) de Manilkara huberi selecionados para os estudos populacionais. Temperatura de anelamento (Ta), número de indivíduos analisados (N), número total de alelos (A), heterozigosidade esperada (He); e heterozigosidade observada(Ho).

 

1Bióloga, bolsista, Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, FUNTEC/IBAMA/DFID.

2Bióloga, mestranda, UFPA, Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia.

3Bolsista, Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, FUNTEC/IBAMA/DFID.

4Bióloga, PhD, Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia - aciampi@cenargen.embrapa.br

Vânia.Cristina.Rennó Azevedo1 Christina Cléo Vinson.2 Valci Pereira da Silva3 Ana Yamaguichi Ciampi.4



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